緒言
漢方薬は複数の生薬の組み合わせで構成されており、原料生薬の品質は産地や収穫時期、部位などによって異なり、それらを把握することは漢方薬および漢方製剤の品質を確保するために重要であると考えられます。
本アプリケーションノートでは産地および部位の異なる桂皮類に含まれる揮発性成分を網羅的に分析することにより、産地や部位に特徴的な成分を明かにすることを試みました。
分析には簡便に揮発性成分を捕集することができるSPME法とノンターゲット分析に適したGC-TOFMSを用いました。さらに、極性の異なる2種類のカラムを接続して分離を行うGCxGC-TOFMSを用いて分析を行い、GC-TOFMSとの比較を行いました。
さらに、桂皮を含む漢方製剤である桂枝茯苓丸（桂皮、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍薬および添加剤としてショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、乳糖水和物を含有する）についても同様に揮発性成分を分析し、使用されている桂皮について明らかにすることを試みました。
試料と前処理
市販の産地の異なる桂皮、桂枝（表1、あらかじめ刻まれているもの）および桂枝茯苓丸（粉末）を各1gずつ20mLバイアルに入れて密封し、SPMEファイバー（ DVB/CAR/PDMS）（Sigma-Aldrich，アメリカ）を用いて60℃で10分間揮発性成分の捕集を行い、GC-TOFMS分析およびGCxGC-TOFMS分析に供しました。
| 品名 | メーカー | 産地 | |
|---|---|---|---|
| 1 | 桂皮1 | A | 中国 |
| 2 | 桂皮2 | B | 中国 |
| 3 | 桂皮3 | B | ベトナム |
| 4 | 桂皮4 | C | ベトナム |
| 5 | 桂枝1 | B | 中国 |
| 6 | 桂枝2 | D | 中国 |
| 7 | 桂枝茯苓丸 | E | – |
表1：サンプルのメーカーおよび産地
分析条件
分析にはPegasus BT4D（LECO，US）を使用しました。（表2）各試料につき繰り返し3回測定を行い、得られたクロマトグラムからChromaTOFソフトウェア（LECO）の自動解析機能によりデコンボリューションによるピーク検出を行いました。化合物の同定はNISTおよびWiley、FFNSCを用いてライブラリ検索を行い、さらに、リテンションインデックスを使用しました。
| GCxGC-TOFMS condition for the sample analysis | |
|---|---|
| Injection | L-PAL3 |
| SPME Fiber | SPME(Fiber;DVB/CAR/PDMS) |
| Inlet Mode | Splitless |
| Inlet Temperature | 250 ℃ |
| Carrier Gas | Helium, 1.2 mL/min |
| 1st Column | BP-20, 60 m ｘ 0.25 mm I.D. ｘ 0.25 µm df |
| 2nd Column | Rxi-5MS, 1.3 m ｘ 0.18 mm I.D. ｘ 0.18 µm df |
| 1st Oven | 40 ℃ (1 min) → 10 ℃/min → 250 ℃ (10 min hold) |
| 2nd Oven | +5 ℃ offset from 1st Oven |
| Modulator | +15 ℃ offset from 2nd Oven |
| Modulation Period | 4 sec. (Hot:1.2 s, Cold:0.8 s) |
| Transfer Temperature | 250 ℃ |
| Source Mode | EI |
| Source Temperature | 230 ℃ |
| Detector | LECO Pegasus BT 4D Time-of-Flight Mass Spectrometer |
| Acquisition Rate | 10 spectra/sec<(GC) 150 spectra/sec(GCxGC)/td> |
| Stored Mass Range | 33 to 500 u |
| Data Processing | |
|---|---|
| Software | ChromaTOF ver.5.40 |
| Peak Finding | Non-Target Deconvolution |
| Library | NIST11,Wiley9,FFNSC |
表2：GCおよびGCxGC-TOFMS-TOFMS分析条件
結果
各試料のクロマトグラムから、ChromaTOFソフトウェアにより自動ピーク同定を行った結果、一次元GCで約900ピーク、GCxGCでは約4000ピークが検出されました（図1）。
また、GCxGCにより検出されたピークについて、検体間比較を行うStatistical Compareソフトウェア（LECO）を用いてデータアライメントを行い、サンプル間で有意差があると判断された化合物について主成分分析およびクラスター解析を行いました（図3、4）。
その結果、中国産ベトナム産、桂枝がそれぞれ特徴的な揮発性成分を有することが示されました。Cinnam aldehyde等、桂皮に特徴的な成分はベトナム産に多く含まれる傾向が見られました。さらに、桂枝茯苓丸は桂枝2および桂皮3と共通の成分を含んでいることが示されました。
（a）桂皮の一次元GCクロマトグラム
図1 桂皮の一次元GCクロマトグラム（a）およびGCxGCクロマトグラム（b）
セスキテルペン類の巨大なピークが確認され、GCxGCではセスキテルペン類と同じ保持時間帯に多数のピークが検出されていることが明確に示されました。
図2 一次元GCとGCxGCの比較
Benzaldehyde検出位置付近を拡大したトータルイオンクロマトグラムを示します。（d, h）
一次元GCではBenzaldehydeとCamphorが共溶出していたが、（d）デコンボリューションによりソフトウェア上でこれら2つのピークを分離検出することが可能でした。（e）
Camphorのデコンボリューション前のスペクトルではBenzaldehyde由来のイオンが目立ちますが、デコンボリューション後のスペクトルではCamphor由来のイオンを抽出することができました。（g）
GCxGCでは二次側の分離が加わることにより、これら2つのピークをクロマトグラム上で分離することが可能でした。（h）
その結果、一次元GCと比較してGCxGCではBenzaldehyde、CamphorともにSimilarityが向上しました。（f, g, i, j）
図3 主成分分析結果
図4 クラスター解析結果
主成分分析結果、クラスター解析結果ともに中国産とベトナム産が類似していることが示されました。
| 中国産 | ベトナム産 | 桂枝1 |
|---|---|---|
| Linary acetate | Cinnamyl alcohol | trans-Linalool oxide(furanoid) |
| (E)-Cinnamyl acetate | Eugenol | a-Phellandene |
| Cyclohexanone,2-acetyl- | Cinnamyl formate | Safrole |
| 2-(2-Adamantan-1-yl-2-oxo-ethyl)-3-amino-4-formyl-cyclopent-3-ene-1,1,2-tricarbonitrile | 2-Methoxycinnaamaldehyde | Linalool |
| a-Copaene-4-ol | Cinnamaldehyde | β-Copaene |
| Benzene,1-(2-butenyl)-2,3-dimethyl- | Cinnamonitrile,(E)- | 2-Propanone,1-methoxy- |
| 1-Naphthol,5,7-dimethyl- | Cinnamaldehyde,o-methoxy- | Ligusticumic acid |
| Camphor | Cinnamic acid,methyl ester,(E)- | 2-Butenal,2-methyl-,(E)- |
| Ethanone,2-(formyloxy)-1-phenyl- | Cinnamic acid | 2H-Pyran,3,4-dihydro-4-methyl- |
| Vetiselinenol | Benzene,1,4-dimethoxy- | 7-Tetradecene |
| Naphthalene,1,2,3,4-tetrahydro-1,5,7-trimethyl- | Benzenemethanol,α-methyl- | Hexanenitrile |
| Isolongifolene,4,5,9,10-dehydro- | Benzofuran,2-methyl- | 3-Hexen-1-ol |
| 1,3-Cyclohexadiene,1,3,5,5,6,6-hexamethyl- | Carvenone | Fenchol,exo- |
| tranas-Calamenene | Benzaldehyde,4-methoxy- | Styrene |
| Cyclohexanol,5-methyl-2-(1-methylethyl)-,acetate,(1・2・5・- | (8R,8aS)-8,8a-Dimethyl-2-(propan-2-ylidene)-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalene | 2-Butanone |
| Benzene,1-methyl-2-(1-methyl-2-propenyl)- | 9-Hexadecen-1-ol,(Z)- | 1-Ethyl-5-methylcyclopentene |
| Cyclohexanone,2-methyl-5-(1-methulethyl)- | 1-Naphthalenol,5,6,7,8-tetrahydro-2,5-dimethyl-8-(1-methylethyl)- | 9-Isopropyl-1-methyl-2-methylene-5-oxatricyclo[5.4.0.0(3.8)]undecane |
| 1H-Cycloprop[e]azulen-7-ol,decahydro-1,1,7-trimethyl-4-methylene-,[1ar-(1a・4a・7・7a・7b・]- | 2-Methyl-6-(p-tolyl)hept-2-en-4-ol | endo-Borneol |
| 1H-Indene,3-ethenyl-2,3-dihydro-1,1-dimethyl- | Megastigma-7(E),9,13-triene | Cyclopentanone,3,4-bis(methylene)- |
| Undeca-3,4-diene-2,10-dione,5,6,6-trimethyl- | 1(2H)-Naphthalenenone,3,4-dihydro-4,5,6-trimethyl- | 2-Tetradecene,(E)- |
| Benzoic acid,1-methylethyl ester | Copaene | Acetone |
| trans-・Bergamotene | 3,7-Cycloundecadien-1-ol,1,5,5,8-tetramethyl- | Benzene,1-methyl-4-(1-methylethenyl)- |
| Azulene,1,4-dimethyl-7-(1-methylethyl)- | Benzonitrile,4-(1-hydroxy-2methyl-3-butenyl)-,(R*,R*)- | Hexanal |
| 10,10-Dimethyl-4-acetyl-tricyclo[5.2.1.0(1,5)]decane | Aromadendran(‘2’) | 2-Butenoic acid,methyl ester |
| Biphenyl | 2-Heptanone,6-(3-acetyl-2-methyl-1-cyclopropen-1-yl)-6-methyl- | Phenylethy alcohol |
| 3.5-Octadien-2-one,(E,E)- | 2H-2,4a-Methanonaphthalene,1,3,4,5,6,7-hexahydro-1,1,5,5-tetramethyl-,(2S)- | 3-Octen-2-one,(E)- |
| Naphthalene,1,2,3,4-tetrahydro-1,1,6-trimethyl- | Benzofuran-2-carboxaldehyde | p-Mentha-1,5,8-triene |
| p-Cresol | Ethanone,1-(2-hydroxyphenyl)- | 2,6,10-Cycloundecatrien-1-one,2,6,9,9-tetramethyl-,(E,E,E)- |
| 2,5-Octanedione | 1,1,7,7a-Tetramethyl-1a,2,6,7,7a,7b-hexahydro-1H-cyclopropa[a]naphthalene | Cyclohexene,1,5,5-trimethyl-3-methylene- |
| 桂枝2 | 桂枝茯苓丸 | 桂枝および桂枝茯苓丸 |
|---|---|---|
| Perhydrophenanthrene,(4aα,4bα,8aα,10aβ)- | (+)-Nopinone | 2-Propanol,1-methoxy- |
| 1-Methoxy-6-phenylcyclohexene | Benzoic acid | Nonane,5-methyl- |
| Heptylcyclohexane | Paeonol | Benzeneethanol,・・dimethyl-,acetate |
| 2-Methylpropyl β-styryl sulfide | Nonane,3-methyl-5-propyl- | Benzene,1,4-dichcloro- |
| 1,5-Heptadien-4-one,3,3,6-trimethyl-(CAS) | Decane,2,2-dimethyl-(CAS) | Tridecane,3-methyl- |
| Perhydrophenalene,(3aα,6aα,9aα,9bβ)- | 3-Heptanone | Propanoic acid,2-methyl-,3-hydroxy-2,2,4-trimethylpentyl ester |
| (4aS*,6aR*,10aS*)-Decahydrobenzo[c]inden-5(1H)-one | 2-Dodecene,(E)- | 1-Hexanol,2-ethyl- |
| 1H-2-Indenone,2,4,5,6,7,7a-hexahydro-3-(1-methylethyl)-7a-methyl | Tetradecane,3-methyl- | Ethyl Acetate |
| Ethanone,1-(4-cyclohexylphenyl)- | Decane,5-ethyl-5-methyl- | Decane |
| 2-Propanol,1-methoxy- | Tetradecane,6,9-dimethyl- | 3-Furaldehyde |
| 3-Octanol,3,7-dimethyl- | 4-Nonene,5-butyl- | 3-Eicosene,(E)- |
| Trichloroethylene | 2,3,3-TRIMETHYLOCTANE | Isoborneol |
| Tetradecahydro-1-methylphenanthrene | 1-Octanol,2,2-dimethyl- | 4-Cyanocyclohexene |
| Methyl methacrylate | Hexane,3-ethyl-3-methyl- | Indan-1,3-diol monopropionate |
| Benzene,1-ethenyl-2-methyl- | Cyclododecane | Phorone |
| Naphthalene,2-butyldecahydro- | Ether,2-ethylhexyl tert-butyl | 2-Butene,2,3-dibromo- |
| 3-Methyl-2,3-dihydro-benzofuran | Heptane,2,2,4,6,6-pentamethyl- | 2-Octen-1-ol,(Z)- |
| Cyclohexanone,2,6-bis(2-methylpropylidene)- | 1,1-Di(isobutyl)acetone | Tribromoacetic acid |
| 1-Octen-3-ol | Formic acid,2-propylpentyl ester | Undecane,4-ethyl- |
| trans-anti-trans-Tetra-decahydroanthracene | 3-Ethyl-2-methyl-1-heptene | Benzene,1,3-dichloro- |
| 1-Hexanol | N-[2,3-Dihydro-5-ethyl-4-oxo-4H-pyran-2-oyl]-(S)-proline-benzyl ester | 7-Octen-2-ol,2,6-dimethyl- |
| 1-Tetradecene | Nonane,5-(2-methylpropyl)- | 3-Tetradecene,(E)- |
| 1H-3a,7-Methanoazulene,octahydro-1,4,9,9-tetramethy-,(1・3a・4・7・8a・- | 2(3H)-Furanone,5-methyl- | 2,3,3-Trimethyl-1-hexene |
| 2-Cyclohexen-1-one,2-(2-methyl-2-propenyl)- | 3-Methyldec-3-ene | 1H-Naphthalen-2-one,3,4,5,6,7,8-hexahydro-4a,8a-dimethyl- |
| Undecane,3-methyl- | Nonane,5-methylene- | 3-Octene,2,2-dimethyl- |
| cis-Z-・Bisabolene epoxide | Hexane,2,2,5-trimethyl-(CAS) | 2,3-Dimethyldecane |
| 5-Isopropyl-2,8-dimethyl-9-oxatricyclo[4.4.0.0(2,8)]decan-7-one | Decane,5-methyl-6-methylene- | trans-2-(2-Pentenyl)furan |
| Nonane,5-methyl- | Butanoic acid | 2-Octene,3,7-dimethyl-,(Z)- |
| 1,4-Methanonaphthalene,6,7-diethyldecahydro-,cis- | Undecane,3-methylene- | 2,3-Dimethyl-3-heptene,(Z)- |
表3 各桂皮類に特徴的な化合物（一部抜粋。化合物名はライブラリ検索結果1位のものを記載）
クラスター解析の結果から、ベトナム産、中国産、桂枝、桂枝茯苓丸に特徴的な化合物の例を表3に示します。
桂皮の特徴的な成分であるCinnam Aldehyde等はベトナム産に多く含まれる傾向が見られました。また、桂枝茯苓丸からは牡丹皮の成分でああるペオノール、安息香酸、芍薬の成分であるノピノンが検出されました。（赤字：桂皮の主要成分、青字：桂枝茯苓丸の主要成分）
結論
高感度ノンターゲット分析が可能なGC-TOFMSを用いることにより、桂皮に含まれる複雑な揮発性成分の網羅的解析が可能でした。また、統計解析手法を組み合わせることにより、桂皮の産地および種類に特徴的な揮発性成分を明らかにすることができました。
さらに、GCxGC-TOFMSを用いることにより、一次元GCでは検出できない化合物を検出することが可能であり、主成分分析およびクラスター解析において産地および種類の違いがより明確に示されました。
しかし、今回の実験では内標準物質を使用していないため、サンプルの吸着およびGC-TOFMS分析におけるばらつきを補正していません。そのため、量的な比較を正確に行うためには内標準物質を使用する必要があると考えられました。
GC-TOFMSまたはGCxGC-TOFMSと統計解析手法を組み合わせることにより、産地および種類の異なる桂皮類の識別が可能であり、本手法は他の生薬にも有用であると考えられました。