緒言
しょうゆは様々な香気成分を含んでいる。これまでに通常の1次元GCを用いて香気成分の分析を行ったが詳細に分離・解析することができなかった。そこで本研究では、GC×GC-TOFMSを用いて製造法の異なるしょうゆに含まれる成分を網羅的に分析し、得られたデータを統計学的に比較することによりそれぞれのしょうゆに特徴的な成分を明らかにするための検討をおこなった。
試料と前処理
試料には、しょうゆ4種を用いた。各試料2mLを20mLバイアルに入れて密封し、SPMEファイバー（DVB/CAR/PDMS）（Sigma-Aldrich，アメリカ）を用いて50 ℃、30 分間ヘッドスペース香気成分の捕集を行い、 GC×GC-TOFMS分析に供した。
| 試料名 | 生産者 | 生産方法 |
|---|---|---|
| Sample 1 | 小豆島A | 木桶 |
| Sample 2 | 小豆島産B | 木桶 |
| Sample 3 | 小豆島産B | ステンレスタンク |
| Sample 4 | 県外産 | ステンレスタンク |
表1：分析に供したしょうゆの概要
GC×GC-TOFMS分析
分析機器にはPegasus 4D（LECO，アメリカ合衆国）を使用し，1次カラムにRtx-WAX（Restek，アメリカ合衆国）、2次カラムにInert Cap-5MS/NP（GLサイエンス，日本）を用いた（表1）。各試料につき繰り返し2回測定を行い、得られたクロマトグラムからChromaTOFソフトウェア（LECO）の自動解析機能によりデコンボリューションによるピーク検出およびライブラリ検索を行った。
| GCxGC-TOFMS condition for the sample analysis | |
|---|---|
| Injection | CTC Combi-PAL |
| SPME Fiber | DVB/PDMS/CAR 50/30 μm |
| Inlet Mode | Splitless |
| Inlet Temperature | 200 ℃ |
| Carrier Gas | Helium, 1.0 mL/min |
| 1st Column | Rtx-WAX, 60 m ｘ 0.25 mm I.D. ｘ 0.25 µm df |
| 2nd Column | Inert Cap 5MS/NP, 1.3 m ｘ 0.18 mm I.D. ｘ 0.18 µm df |
| 1st Oven | 50 ℃ (5 min) → 8 ℃/min → 250 ℃ (8 min hold) |
| 2nd Oven | +5 ℃ offset from 1st Oven |
| Modulator | +20 ℃ offset from 2nd Oven |
| Modulation Period | 4 sec. (Hot:0.8 s, Cold:1.2 s) |
| Transfer Temperature | 230 ℃ |
| Source Mode | EI |
| Source Temperature | 230 ℃ |
| Detector | LECO Pegasus 4D Time-of-Flight Mass Spectrometer |
| Acquisition Rate | 100 spectra/sec |
| Stored Mass Range | 29 to 550 u |
| Data Processing | |
|---|---|
| Software | ChromaTOF ver.4.72 |
| Peak Finding | True Signal Deconvolution |
| Library | Wiley10, NIST14 |
表2：GC×GC測定条件
図1：GCxGC分離の原理
1次カラム、2次カラムとモジュレーターによって構成される。両カラムの接合部にモジュレーターを配置することで、二次元分離が可能となる。モジュレーターは1次カラムで分離されてきた化合物を、コールドジェットおよびホットジェットによりトラップ&リリースして2次カラムへ導入する。化合物が2次カラムでさらに分離されることによりGCxGCクロマトグラムの縦軸の分離を生み出す。この機構により、一回の測定で多数の化合物の分析が可能となる。
図2：しょうゆの2次元クロマトグラム
結果
各試料の2次元クロマトグラムから、ChromaTOFソフトウェアにより自動ピーク同定を行った結果、約500ピークが検出された（図2）。検出されたピークの中からしょうゆの特徴的な香気成分について、各試料における存在比を比較した（表3、図2、3）。また、検体間比較を行うStatistical Compareソフトウェア（LECO）を用い、データアライメントおよび全検出化合物の分散比に基づくFisher Ratio値（F.R.）を算出し、検体間で差があると判断された化合物を抽出し、更に有意差の高いF.R.5.0以上の化合物を用いて、統計解析を組み合わせることにより、各試料に特徴的な成分を抽出した（表4、図4、5）。
表3：しょうゆの特徴的な香気成分の面積値
図3：しょうゆの特徴的な香気成分の検出位置
右側の3次元表示のクロマトグラムの上部に1次元表示のクロマトグラムを示した。しょうゆの特徴的な香気成分の検出位置は1次側の保持時間が同じ位置に多くの成分が重なって検出されており、通常の1次元クロマトグラムでは正確な分離は難しいと考えられたが、GC×GCにより正確に分離抽出することが可能であった。
図4：主成分分析結果
図5：クラスター解析結果
ステンレスタンク醸造のSample3は同じくステンレスタンク醸造のsample4よりsample2と類似していることが示された。
| Sample 1 | Sample 2 | Sample 3 | Sample 4 |
|---|---|---|---|
| HEPTANOIC ACID | 1, 1, 5-Trimethyl-1, 2-dihydronaphthalene | Linalool | Acetic acid, butyl ester |
| 2(3H)-Furanone, 5-ethyldihydro- | 2-methyl-5-[(methylthio)methyl]furan | Furfural | 2-(1-Ethoxyethoxy)-3-methyl-1,4-butanediol |
| Ethyl (S)-(-)-lactate | 1-Pentanol, 4-methyl- | Nonanoic acid, ethyl ester | 1-Propene, 3,3′,3”-[methylidynetris(oxy)]tris- |
| 2,2,5-Trimethyl-3-hexanone | Octanoic acid, ethyl ester | 2-Hexenal, 2-methyl- | 2-CYCLOHEXEN-1-ONE, 3,5,5-TRIMETHYL- |
| 1,3-Dioxolane, 4-methyl-2-(2-methylpropyl)- | ETHYL 2-HYDROXY-4-METHYLPENTANOATE | (5-METHYL-2-FURYL)METHANETHIOL | Dihydro-2(5)-ethyl-3(2H)-thiophenone |
| Pentanenitrile, 4-methyl- | BUTANEDIOIC ACID, DIETHYL ESTER | Guaiacol | 3-Hexanone, 4-hydroxy- |
| 3-Heptanone, 2,6-dimethyl- | Furan, 2,2′-methylenebis[5-methyl- | Benzenepropanoic acid, à-methyl-, ethyl ester | 1,5-Octadien-3-ol, (Z)- |
| (1-PENTYLHEXYL)BENZENE | 2,4-Hexadienoic acid, ethyl ester | 1,2-Benzenediol, 3,5-bis(1,1-dimethylethyl)- | Pyrazine, tetramethyl- |
| 2-Butanone, 3,4-epoxy-3-ethyl- | PROPANOIC ACID, ETHYL ESTER | 2-Isopropyloxan-4-one | 7-Octen-4-ol |
| Propanoic acid, 2-methyl-, 1-(1,1-dimethylethyl)-2-methyl-1,3-propanediyl ester | Ethanone, 1-(2-furanyl)- | 2,4-Hexadiene, 2,5-dimethyl- | 4-Methylpentan-2-ol, tert-butyldimethylsilyl ether |
| 2-Isopropyloxan-4-one 2 | 6,7-Dodecanedione | Cyclohexane, (1-methylethylidene)- | Pyrazine, 5-ethyl-2,3-dimethyl- |
| Benzene, (isocyanomethyl)- | 2-Isopropyl-5-methylhex-2-enal | 2,5-cyclohexadien-1-one, 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxy-4-methyl- | 2(3H)-Furanone, dihydro-3-methyl- |
| 2-METHYL-3-ISOPROPYLPYRAZINE | PROPANOIC ACID, 2-METHYL-, ETHYL ESTER | 5,5-Dimethyl-1,3-dioxane-2-ethanol | 1,3-Octadiene |
| 2-undecanol | Acetaldehyde | 2-Butanone, 3-hydroxy- | 2(3H)-Furanone, dihydro-5-methyl- |
| 2-Furfurylmethylsulfide | 1-Butanamine, N-(2-furanylmethylene)-3-methyl- | METHYLPHENYLACETATE | Levulinic acid, ethyl ester |
表4：各試料に特徴的な成分（F.R.上位15化合物）
しょうゆの特徴的な香りをもつ化合物としてsample1からはフラノン類、アルコール類、sample2からはエステル類、sample3からはLinalool、furfural、フェノール類、sample4からはピラジン類、フラノン類、フェノール類が多く検出された。
結論
GC×GC-TOFMSによりしょうゆに含まれる多様な香気成分を分離し網羅的に分析することができ、F.R.の算出およびクラスター解析により試料間の差異を効率よく抽出し、各サンプルに特徴的な成分を明らかにすることができた。
GC×GC-TOFMSによる網羅的分析法と検体間比較法および統計学的解析法を組み合わせた本分析法は、多くの食品に適用することが可能であり、サンプル中からより多くの情報を網羅的に取得することで、複雑な香気成分を明かにすることができる分析手法であると考えられた。更に、多変量解析と組み合わせることにより、製造元の違いを正確に捉えることができるため、様々な条件による差異解析などに有用であると考えられる。
この内容は2018年質量分析総合討論会で発表したものです。